Содержание3.Получение ИФА-конъюгатов на основе МКАТ 2
3.1. Основные принципы 2
3.2.Конъюгация пероксидазы хрена (ПХ) с IgG 4
3.3.Конъюгация щелочной фосфатазы с IgG одноэтапным методом с использованием глутарового альдегида 6
3.4. Контроль качества конъюгатов 6
Оборудование и принадлежности 9
Буферы и растворы 9
Технологическая схема получения МКАТ 16
Получение иммуногена 16
Первичный скрининг гибридом в ИФА 16
Клонирование гибридных клеток 17
Получение асцитической мжидкости 17
Список литературы 18Введение3.Получение ИФА-конъюгатов на основе МКАТ
3.1. Основные принципы
Самостоятельное приготовление конъюгата антител с ферментом - задача, вполне посильная для любого квалифицированного специалиста. Основное условие ее успешного решения - наличие хорошей гипериммунной антисыворотки, главные критерии качества которой - специфичность и необходимый титр. Остальные этапы довольно просты. Самостоятельно приготовленные конъюгаты, как правило, дешевле коммерческих. Кроме того, некоторые конъюгаты нужной специфичности не выпускаются в виде коммерческих реагентов. При пересылке коммерческих конъюгатов практически всегда существует риск снижения или даже потери их активности из-за неоптимальных условий при транспортировке или в местах хранения, особенно при доставке в отдаленные от производителя страны. Поэтому качество коммерческих конъюгатов, также как и приготовленных самими исследователями, необходимо тщательно контролировать в той реакции, для которой он предназначен. Основываясь на перечисленных соображениях, многие предпочитают готовить конъюгаты самостоятельно. Приготовленный однажды конъюгат при правильном хранении сохраняет активность в течение нескольких лет. Наиболее часто применяют конъюгаты с антиглобулинами, которые могут служить универсальными реагентами для различных по специфичности реакций. В то же время конъюгировать с ферментом можно антитела любой специфичности и любого изотипа, в том числе моноклональные; необходимо лишь, чтобы они были доступны в достаточном количестве. С помощью описанной ниже методики можно приготовить конъюгат всего из 100 мкг антител. Эта же методика подходит и для присоединения ферментной метки к любому белковому антигену, однако в этом случае оптимальное соотношение между количеством фермента и сшивающего реагента необходимо подбирать индивидуально, методом проб и ошибок [10].
В настоящем разделе описано приготовление конъюгатов ферментов с бараньими и кроличьими антителами. Необходимое оборудование и реагенты перечислены в табл. 3.1. При работе с антителами других животных используют те же методики. Возможность применения того или иного метода зависит от выбранного фермента (см. табл. 3.1). Ниже описаны методики конъюгации антител с пероксидазой хрена (ПХ) и щелочной фосфатазой (ЩФ). Исходным материалом для приготовления конъюгата служит очищенная фракция IgG из гипериммунной сыворотки. Ее получают осаждением сульфатом аммония и последующей анионообменной хроматографией на целлюлозе DE-52.Литература1. Goding J. Monoсlonal antibodies. Principles and practice. Acedemic press, San Diego, 1996.
2. Ніколаєнко І.В. Отримання та порівняльний аналіз гібридом-продуцентів моноклональних антитіл, що диференціюють вакцинні та вірулентні поліовіруси І, ІІ та ІІІ типів: Дисертація ..... канд. мед. наук. - Київ, 1999. - 148 с.
3. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с.
4. Галкин А.Ю., Николаенко И.В. Гибридомная технология: принцип и применение // Біотехнологія. Освіта. Наука: Тези доповідей учасників I Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих вчених (10-11 лютого 2003 р., м. Київ) / Укл.: І.В.Повстянко, О.Ю.Галкін. - К.: "Видавництво "Політехніка", 2003. - С.74 - 75.
5. Методичні вказівки до виконання організаційно-економічної частини дипломних робіт для студентів хіміко-технологічних спеціальностей всіх форм навчання / Укл.: В.В. Янковий, М.П. Дорошенко, І.О. Попов. - К.: НТУУ "КПІ", 1999. - 40 с.
6. Смирнов В.В., Сельникова О.П., Думанський В.Д., Мойсеєва Г.В., Гриневич О.Й. Імунобіологічні препарати. Довідник. К.: Моріон, 2001. - 192 с.
7. Фармацевтичний ринок України 2002 / Медичний ринок. - 2003. - №1. - С. 17 - 18.
9. Биотехнология. В 8 кн. / Под ред. Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова Кн. 3. Клеточная инженерия. / Р.Г.Бутенко, М.В.Гусев, А.Ф.Киркин и др. - М.: Высш. ш., 1987. - 127 с.
10. Bains W/ Biotechnology from A to Z.IRL Press, Oxford, England, 1998.
11. Goding J. Antibody production by hybridomas. - J. of immunol. Methods, 1980, - V.39. - P. 285-308.
12. Иммунологические методы / Под ред. Х.Фримеля. - М.: Мир, 1979. - 520 с.
13. Антитела. Методы: Кн.1: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти.- М. :Мир, 1991. - 287с.
14. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа: Пер. с англ. / Под ред. Р.Г.Кеннета. - М. :Медицина, 1987. -416с.
15. Антитела. Методы: Кн.2: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти.- М. :Мир, 1991. - 320с.
16. Методы иммунохимического анализа в биологии развития (практическое руководство) / А.Т.Михайлов, В.Н.Симирский. - М.: Наука, 1991. - 288с."
|
|
